Всеволод Пудовкин родился третьим ребёнком в многодетной семье. Через четыре года семья переехала жить в Москву. Отец Илларион Епифанович происходил из крестьян Пензенской губернии, работал приказчиком и коммивояжером. Мать Елизавета Александровна (в девичестве Шилкина) занималась домашним хозяйством.

После переезда в Москву учился в шестой Московской гимназии, потом на отделении естественных наук физико-математического факультета МГУ, но не успел сдать выпускных экзаменов. В 1914 году ушёл на фронт Первой мировой войны, был ранен, взят в плен (в лагере под Килем в Померании работал химиком), бежал, вернулся уже в Советскую Россию.

Могила Пудовкина на Новодевичьем кладбище Москвы.
Вернувшись в Москву, Пудовкин устраивается делопроизводителем в военкомат, а через некоторое время находит работу химика в лаборатории завода «ФОСГЕН-1».

В 1920 году поступил в Первую государственную школу кинематографии при Всероссийском фотокиноотделе Наркомпроса (ныне — ВГИК) (класс В. Р. Гардина, позже — в студии Л. В. Кулешова).

Окончив студию Л. Кулешова в 1925 году и создав в качестве актёра первый в истории кино образ большевика и ряд эксцентрических и сатирических образов, Пудовкин становится кинорежиссёром.

С 1925 года работает на студии «Межрабпом-Русь» (с 1936 года — «Союздетфильм», с 1948 года — киностудия имени М. Горького).

В 1926 году Пудовкин вместе со сценаристом Н. А. Зархи и оператором А. Д. Головнёй создаёт фильм «Мать» по одноимённому роману М. Горького. Фильм стал крупнейшим достижением советского кинематографа.

Следующий фильм — «Конец Санкт-Петербурга» (1927), созданный Всеволодом Пудовкиным, Натаном Зархи и Анатолием Головнёй, — также принадлежит к лучшим достижениям киноискусства. Третьим шедевром Пудовкина считается картина «Потомок Чингисхана» (1929).

Пудовкин был председателем Российской ассоциации работников революционной кинематографии; с 1944 года — президентом киносекции Всесоюзного общества культурных связей с зарубежными странами, членом Советского комитета защиты мира.

Автор книг «Кинорежиссёр и киноматериал» (1926), «Киносценарий. Теория сценария» (1926), «Актёр в фильме» (1934).

Преподавал во ВГИКе на режиссёрском факультете (с 1950 года — профессор).

Жена (с 1924 года) — актриса Анна Николаевна Земцова (экранный псевдоним Анна Ли) (сыграла главную героиню в фильме Пудовкина «Шахматная горячка» и роль курсистки-революционерки Анны в «Матери», затем перестала сниматься).

Всеволод Илларионович Пудовкин скончался 30 июня 1953 года в Юрмале (район Дубулты), близ Риги (по другим данным в Москве). Накануне он заболел гриппом, сопровождавшимся высокой температурой. Не оправившись от болезни, вернулся к активным физическим нагрузкам — игре в теннис. В последующую ночь у Пудовкина диагностировали инфаркт миокарда. Через сутки ему стало лучше, но при попытке встать его поразил инфаркт лёгкого и остановка сердца. Похоронен на Новодевичьем кладбище (участок № 2).